|
文章列表
2025-03-24
|
新聞詳情
原代細(xì)胞難轉(zhuǎn)染怎么辦？7
發(fā)表時間：2021-07-19 11:13 原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染比常規(guī)小核酸轉(zhuǎn)染更困難。以下原代細(xì)胞廠家的小編分享了有關(guān)原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一些注意事項。希望能夠幫助到大家。
使用RFect系列小分子核酸轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染檢測實驗時的注意事項： 1、細(xì)胞接種：通常在轉(zhuǎn)染前1天進(jìn)行接種/鋪板(細(xì)胞數(shù)約為5*10^4個細(xì)胞/ml)，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度為30～50%。如果細(xì)胞是原代細(xì)胞，接種密度將為：細(xì)胞數(shù)為2*10^6細(xì)胞/ml。在細(xì)胞狀況穩(wěn)定后，可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/接種漂浮細(xì)胞(細(xì)胞計數(shù)約為 5 * 10 ^ 4 個細(xì)胞/毫升)。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度為30-40%。 2、初次使用建議使用24孔板，以增強(qiáng)使用過程中的轉(zhuǎn)染效果。每孔使用 2 ul 轉(zhuǎn)染試劑。只需將好的轉(zhuǎn)染條件(siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑的數(shù)量和比例)擴(kuò)展到相應(yīng)的孔板。 3. 將siRNA終濃度的四個梯度設(shè)置為10nM、30nM、50nM和100nM。應(yīng)該在每個梯度中創(chuàng)建幾個重復(fù)的孔(至少兩個重復(fù)的孔以避免實驗錯誤)。 4. 用于稀釋siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基必須是無血清培養(yǎng)基，因為血清的存在會干擾siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合，影響轉(zhuǎn)染效率。 5、檢測方法：轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞進(jìn)行qPCR基因水平檢測。轉(zhuǎn)染72小時后，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，用于Western blotting蛋白水平檢測。 |
