超詳細:WB 常見問題及解決方案

1. 免疫印跡

蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡 (Western blot，簡稱 WB) 是一種常見的實驗室方法，用于檢測蛋白質(zhì)并評估其表達水平。根據(jù)其分子量和與特定抗體的免疫反應(yīng)性來鑒定感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡由一系列相互關(guān)聯(lián)的步驟組成 (圖 1)。

蛋白質(zhì)印跡相互關(guān)聯(lián)步驟：

(1) 將樣品 (通常是蛋白質(zhì)混合物) 加載到凝膠上。Marker 標記包含各種已知分子量的預(yù)標記蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)樣品一起加載到凝膠上作為尺寸參考。

(2) 凝膠電泳用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量來分離蛋白質(zhì)。

(3) 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移或“印跡”到膜上。

(4) 封閉膜以減少非特異性結(jié)合，然后依次用特異性結(jié)合目標蛋白的一抗和二抗進行探測。后者結(jié)合一抗并攜帶允許隨后檢測的酶或熒光團。

(5) 分別通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或熒光檢測信號。

(6) 準備蛋白質(zhì)印跡圖像以供發(fā)表。

由于該實驗時間長、細節(jié)多，從樣品制備到顯影，每個步驟中都可能存在問題，最后得到的條帶往往千奇百怪、不盡人意……在這篇推文中，我們將為您介紹一些常見的 WB 實驗問題以及相應(yīng)的解決方案。

2. 免疫印跡常見問題及解決方案

2.1 問題一：背景高

2.2 問題二：信號弱或完全缺失

2.3 問題三：出現(xiàn)“非特異性”條帶、多帶等現(xiàn)象

2.4 其他問題

2.4.1. 微笑條帶：

可能性原因：遷移過快、電泳緩沖液溫度偏高、蛋白質(zhì)超載或孔內(nèi)運行緩沖液不足。
建議：應(yīng)降低遷移速度、預(yù)冷緩沖液、減少蛋白上樣量、緩沖液完全覆蓋孔，確保內(nèi)室緩沖液不會泄露到外室[4][6]。

2.4.2. 皺眉條帶：

可能性原因：裝置不合適，可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

建議：可通過調(diào)整裝置來避免該問題。

2.4.3. 條帶拖尾：

可能性原因：樣品溶解不好；存在一定程度地蛋白降解；電泳液反復(fù)多次使用。

建議：樣品充分溶解混勻后上樣；盡量使用新鮮樣本；使用新鮮配制的電泳緩沖液。

2.4.4. 啞鈴狀不均勻條帶：

可能性原因：配置膠有問題，膠凝固后不均一；樣品可能含有過多雜質(zhì)。建議：重新配置膠，確保膠質(zhì)量無問題來避免該現(xiàn)象出現(xiàn)；在樣品使用前離心。

2.4.5. 條帶粘連：

可能性原因：可能是上樣量太多，或者是制膠問題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。建議：可通過減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來避免。

2.4.6. 條帶空泡：

可能性原因：轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡建議：確保在組裝“三明治”時，移除凝膠和印跡膜間的所有氣泡。

2.4.7. 背景有不均勻的黑色斑點：

可能性原因：封閉液未完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導(dǎo)致發(fā)光時候膜上形成黑點；或抗體在膜上分布不均；

建議：封閉液一定要充分溶解，封閉結(jié)束之后要用 TBST清洗三遍再加一抗；抗體孵育時保持搖動。

2.4.8. 條帶空斑：

可能性原因：目的蛋白條帶中間空白，周圍背景正常。該現(xiàn)象可能是一抗二抗?jié)舛冗^高，促使底物過快消耗，從而導(dǎo)致在進行化學(xué)發(fā)光時，底物耗盡形成空斑。