外泌體整體服務(wù)

外泌體（Exosome）是一種由細(xì)胞分泌的膜性囊泡小體，其直徑通常為30-100nm，比其它的一些囊泡（凋亡小體）要小得多。外泌體廣泛存在于各種體液中，可攜帶蛋白質(zhì)、脂類、核酸（miRNAs，ncRNAs）等多種生物功能大分子。新的研究表明，外泌體形成了一種特殊的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，它不僅影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，而且還與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。外泌體領(lǐng)域的研究已經(jīng)在癌癥的診斷及治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，基于質(zhì)譜的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)是研究外泌體不可或缺的一項技術(shù)手段。

外泌體具有磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其沉降系數(shù)和蛋白質(zhì)聚集體有著很大的不同。而且外泌體膜表面存在特異性膜蛋白如CD9和CD81，前者被證實和腫瘤遷移有關(guān)，后者與丙型肝炎病毒的侵染有關(guān)。而因為外泌體具有這些顯著的易分離的特點，我們可以通過密度梯度離心，親和層析等方法對外泌體進(jìn)行分離和純化。

1.    外泌體提取-800元/樣本

超速離心是從生物體液或細(xì)胞上清分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)方法。采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。目前在國內(nèi)外普遍應(yīng)用的經(jīng)典技術(shù)手段。

一、技術(shù)簡介：

外泌體（Exosomes）是一種直徑在30-200 nm的微小囊泡，可由機體眾多類型細(xì)胞釋放，并廣泛分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液當(dāng)中。外泌體可攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA,參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程。

目前外泌提取主要有超速離心、過濾離心、試劑盒提取等方法。其中超速離心分離得到外泌體，純度高，得率大，可滿足于后續(xù)不同實驗的需求。本公司具備貝克曼的超高速離心機，隨到隨分，效率高，質(zhì)量有保證

二、服務(wù)流程：

培養(yǎng)上清樣本：

1. 培養(yǎng)液收集（干冰保存運輸）。

2. 低速離心去除細(xì)胞、碎片及雜質(zhì)。

3. 超速離心獲得外泌體沉淀。

4. 外泌體純化。

5.BCA法檢測外泌體濃度。

6.提供實驗報告。

血清/血漿樣本：
1. 分離得到血漿/血清（血清血漿干冰保存運輸，全血抗凝冰袋運輸）。

2.低速離心去除碎片及雜質(zhì)。
3. 超速離心獲得外泌體沉淀。
4. 外泌體純化。
5. BCA法檢測外泌體濃度。
6. 提供實驗報告。

三、結(jié)果形式：

1. 客戶提供：血清或血漿（3-5ml）;培養(yǎng)基（50-100ml），或委托我公司代為培養(yǎng)收集細(xì)胞上清

2.公司提供：基本實驗步驟、圖片、數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

3.實驗周期：3個工作日

4.儀器設(shè)備：超高速離心機（品牌：BECKMAN    型號：Optima XPN-100）

2.     外泌體粒徑檢測-500元/樣本

一、技術(shù)簡介：

納米顆粒跟蹤分析（Nanoparticle TrackingAnalysis, NTA）是對每個顆粒的布朗運動進(jìn)行追蹤和分析，結(jié)合Stockes-Einstein方程式計算出納米顆粒的流體力學(xué)直徑和濃度，檢測10nm–1000nm 范圍內(nèi)的顆粒。NTA技術(shù)已被外泌體研究領(lǐng)域認(rèn)可為外泌體表征手段之一；相較于其他表征方式，NTA技術(shù)的樣本處理更簡單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度更快。

二、服務(wù)流程：

1. 客戶提供外泌體（干冰運輸）

2.外泌體粒徑檢測。
3. 提供實驗報告。

三、結(jié)果形式：

1. 客戶提供：外泌體（30ul-50ul）

2.公司提供：基本實驗步驟、圖片、數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

3.實驗周期：3個工作日

儀器設(shè)備：馬爾文納米顆粒跟蹤分析儀Nanosight NS300

3.     外泌體透射電鏡鑒定-1000元/樣本

一、透射電鏡檢測外泌體原理：

雙層囊膜結(jié)構(gòu)（茶托狀）是外泌體重要標(biāo)志之一，但普通光學(xué)顯微鏡難以觀察到此種亞顯微結(jié)構(gòu)。而透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope, TEM) 分辨率可達(dá)0.1 -0.2 nm，可將被觀察物體放大至數(shù)百萬倍，是外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀測的經(jīng)典方法。

二、服務(wù)流程：

1.外泌體戊二醛固定（冰袋運輸）。

2.外泌體電鏡制樣。

3.上機觀察。

4.提供實驗報告。

三、實驗流程：

1. 客戶提供：外泌體（30-50 μl）。
2. 公司提供：實驗步驟，實驗報告和原始圖片。
3. 實驗周期：2-3周。

4.儀器設(shè)備：透射電子顯微鏡 FEITecnai G2 Spirit

4.外泌體WB鑒定

外泌體（Exosome）主要檢測指標(biāo)為CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，針對外泌體的定性檢測，至少選擇2-3個指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表要求。本公司提供外泌體標(biāo)記蛋白檢測和相關(guān)抗體

5.     外泌體熒光標(biāo)記-3000元/樣本

1.    親脂性染料:PKH-67（green）/PKH-26（red）

染料可以穩(wěn)定的與細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光，主要用于細(xì)胞體外標(biāo)記、體外細(xì)胞增殖研究以及體內(nèi)外的細(xì)胞失蹤研究。PKH67的體內(nèi)熒光半衰期為10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更長的半衰期，標(biāo)記在兔紅細(xì)胞上的PKH26半衰期長達(dá)100天以上。特別適用于體外增殖研究以及長期的體內(nèi)細(xì)胞跟蹤研究。

2. 親脂性羰花青染料（carbocyaninedyes）:DiI/DiD/DiO/DiR

DiI, DiO, DiD, DiR是一系列親脂性的熒光染料，可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。這些環(huán)境敏感性熒光染料在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強度大大增強。且具有消光系數(shù)高、極性依賴性、激發(fā)態(tài)壽命短等特點。一旦進(jìn)入細(xì)胞膜后，可在整個細(xì)胞膜上擴(kuò)散，最佳濃度時可以使整個細(xì)胞膜染色。

6. 外泌體RNA測序

送樣要求：

1）血漿樣本采集：EDTA抗凝管采集患者血液，若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過4 h）；將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20min，去除血液中的細(xì)胞；取上清，4℃下3000 g，離心15min，收集上清（血漿），-80℃保存。送樣量：   4mL

注意事項：1. 請勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放； 2. 請排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。

2）血清樣本采集：用促凝管采集患者血液，若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過4 h）；將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20min，去除血液中的細(xì)胞；

取上清，收集上清（血清），-80℃保存。送樣量： 4 mL 注意事項：1. 請排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。

3）尿液樣本采集：采集前/中后段晨尿約60 mL，若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；將采集到的尿液在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除尿液中的細(xì)胞；-80℃保存。送樣量：60 mL。

注意事項：請務(wù)必囑咐患者，i)采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；ii)中段尿請務(wù)必去掉最初排出的50-80 mL尿液；iii）女性受試者，請于采尿前對外陰進(jìn)行清洗。

4）胸水樣本采集臨床收集胸水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；將收集到的胸水1000 g離心10 min，收集上清液；將得到的胸水上清3000 g離心10min，收集上清，-80℃保存。送樣量：30 mL

5）腹水樣本采集臨床收集腹水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；將采集到的腹水在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20min，去除腹水中的殘渣；-80℃保存。送樣量：30 mL。

6）腦脊液樣本采集采集方式為腰椎穿刺，樣本一經(jīng)分離，請務(wù)必立即置于冰上或4℃短暫保存（不得超過4 h），采樣時注意避免血液污染；樣本室溫下2000 g離心20min去除細(xì)胞及部分碎片，取上清，-80℃保存。送樣量：5 mL 注：請勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放。

7）膽汁樣本采集用無菌容器收集膽汁；將收集到的膽汁在4℃下，3000 g離心10 min去除細(xì)胞沉渣和碎片；收集膽汁上清液，4℃或者-20℃長期保存。送樣量：5 mL

8）細(xì)胞上清樣本采集

對于耐受無血清培養(yǎng)的細(xì)胞的處理流程：對于貼壁細(xì)胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細(xì)胞2-3遍去除殘留牛血清，添加無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。細(xì)胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過膜或者10000g離心30min。儲存運輸：將處理好的細(xì)胞上清收集在無菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運輸，體積需求細(xì)胞上清原液大于100ml .對于一些狀態(tài)良好的細(xì)胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。

對于不耐受無血清培養(yǎng)的細(xì)胞的處理流程：對于貼壁細(xì)胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細(xì)胞2-3遍去除殘留牛血清，添加含5%無外泌體血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。細(xì)胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過膜或者10000g離心30min。將處理好的細(xì)胞上清收集在無菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運輸，體積需求細(xì)胞上清原液大于100ml.對于一些狀態(tài)良好的細(xì)胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。送樣量：細(xì)胞上清原液建議大于100 mL。